 |
1.3.3. Исходные растворы. 1.3.4. Анализ методом ОТ-ПЦР в реальном времени. 1.3.5. Исходные растворы для анализа методом ПЦР в реальном времени
|
|
|
|
1. 3. 3. Исходные растворы
i) В продаже имеются вода, не содержащая от нуклеаз, реагент для экстрагирования РНК, хлороформ, гликоген, изопропиловый спирт (пропан-2-ол), этиловый спирт, случайные гексануклеотидные праймеры, буфер для синтеза первой цепи, альбумин бычьей сыворотки (ацетилированный), dNTPs, DTT, обратная транскиптаза вируса мышиного лейкоза Молони, ПЦР реакционный буфер (10х), MgCl2 и Taq-полимераза.
ii) Праймеры в концентрации 10 пмоль/мкл: последовательность Праймера 1 5’-GCCTG-GTCTT-TCCAG-GTCT-3’ (положительная цепь); последовательность Праймера 2 5’-CAGT-CCCCT-TCTCA-GATC-3’ (отрицательная цепь).
1. 3. 4. Анализ методом ОТ-ПЦР в реальном времени
Для анализа методом ОТ-ПЦР в реальном времени можно использовать те же процедуры экстрагирования полной РНК из тестируемого или контрольного образца с последующей обратной транскрипцией экстрагированной РНК, как для традиционной процедуры на основе электрофореза в агарозном геле. Автоматическое экстрагирование всей нуклеиновой кислоты из образцов с последующими автоматизированными программами пипетирования для этапов ОТ и ПЦР (Reid et al., 2003), можно использовать в качестве альтернативы описанным выше процедурам, осуществляемым вручную. ПЦР амплификация ОТ продукта производится различными методами. Также был описан более простой одноэтапный метод для объединения этапов ОТ и ПЦР (Shaw et al., 2007), и он широко используется лабораториями. После амплификации в реальном времени обнаружения ПЦР продуктов в агарозном геле не требуется.
i) Взять ОТ продукты из этапа 19 (см. выше).
ii) Подготовить смесь для ПЦР, описанную ниже, для каждого образца. Снова рекомендуется подготовить смесь в большом объеме для того количества образцов, которые подлежат тестированию, плюс один дополнительный образец: вода, не содержащая нуклеаз (6 мкл); ПЦР мастер-микс, 2х конц. (12. 5 мкл); прямой праймер для ПЦР в реальном времени, 10 пмоль/мкл (2. 25 мкл); обратный праймер ПЦР в реальном времени 10 пмоль/мкл (2. 25 мкл); меченный зонд, 5 пмоль/мкл (1 мкл).
|
|
|
iii) Для каждой пробы, подлежащей анализу, в лунку планшета для ПЦР в реальном времени добавить 24 мкл ПЦР реакционной смеси, а затем 1 мкл ОТ продукта до получения итогового реакционного объема 25 мкл.
iv) Центрифугировать планшет в течение 1 минуты в подходящей центрифуге для перемешивания содержимого каждой лунки.
v) Поместить планшет в машину ПЦР в реальном времени для ПЦР амплификации и прогнать по следующей программе:
50°С в течение 2 минут: 1 цикл;
95°С в течение 10 минут, 1 цикл;
95°С в течение 15 секунд, 60°С в течение 1 минуты: 50 циклов.
Возможно, будет необходимо оптимизировать временные периоды и температуры для конкретных ферментов, реагентов и ПЦР оборудования, используемых в отдельных лабораториях.
vi) Считывание результатов: Для каждой ПЦР реакции нужно определить величину порогового цикла, исходя из кривых амплификации (кривая сигнала флюоресценции относительно количества циклов; возможно для разных типов образцов будут уместны разные точки разделения; Parida et al., 2007). Отдельным лабораториям, используя соответствующие эталонные материалы, следует определять величины порогового цикла (Ct), используемые для классификации образцов, как положительных или отрицательных по наличию вируса ящура. Например, в Референтной лаборатории МЭБ в Пирбрайте, отрицательные тестируемые образцы и отрицательные контроли должны иметь показатель порогового цикла (Ct) > 50. 0. Положительные тестируемые образцы и положительные контроли должны иметь показатель порогового цикла (Ct) < 40. Образцы с показателями порогового значения, находящимися в пределах 40-50, обозначаются как «пограничные» и могут быть протестированы повторно. Сильно положительные в отношении ящура образцы имеют значение порогового цикла ниже 20. 0 (Reid et al., 2001).
|
|
|
1. 3. 5. Исходные растворы для анализа методом ПЦР в реальном времени
i) У коммерческих поставщиков можно приобрести воду, не содержащую нуклеаз, и мастер-миксы для ПЦР в реальном времени.
ii) Для ПЦР в реальном времени на наличие вируса ящура можно использовать любой из следующих праймеров или наборов зондов:
5’UTR (Reid et al., 2001) Прямой праймер: CACYT-YAAGR-TGACA-YTGRT-ACTGG-ТAC; Обратный праймер: CAGAT-YCCRA-GTGWC-ICITG-TTA и меченный зонд: CCTCG-GGGTA-CCTGA-AGGGC-ATCC.
3D (Callahan et al., 2002) Прямой праймер: ACTGG –TTTT-ACAAA-CCTGT-GA; Обратный праймер: GCGAG-TCCTG-CCACG-GA и меченный зонд: TCCTT-TGCAC-GCCGT-GGGAC.
1. 3. 6. Молекулярная эпизоотология
Молекулярная эпизоотология ящура основана на сопоставлении генетических различий между вирусами. Опубликованы дендограммы, демонстрирующие геномное родство между вакцинными и полевыми штаммами по всем семи серотипам на основании последовательностей, полученных из гена 1D (кодирующего VP1 вирусный белок) (Knowles & Samuel, 2003; см. также http: // www. wrlfmd. org/). Сравнение полногеномных последовательностей делает возможной дальнейшую дифференциацию между близкородственными вирусами и помогает воссоздать пути передачи между фермами в зонах вспышек (Cottam et al., 2008). В настоящее время предпочтительным способом получения данных о последовательности для проведения таких сравнений является ОТ-ПЦР амплификация РНК вируса ящура с последующим нуклеотидным секвенированием. Во многих лабораториях разработаны методы для проведения таких исследований, а в референтных лабораториях имеются базы данных, содержащие свыше 6000 частичных последовательностей.
Рекомендуемый метод для анализа VP1является следующим:
i) Экстракция РНК вируса ящура непосредственно из суспензий эпителия или из материала низкого пассажа в культуре клеток.
ii) Осуществление ОТ-ПЦР полного 1D гена (при наличии только части 1D гена полезнее всего использовать 3’концевой сегмент данного гена).
iii) Определение последовательности нуклеотидов ПЦР продукта (или, как минимум, 170 нуклеотидов [предпочтительно 420 для SAT типов] на 3’ концевом сегменте данного гена).
Имеется протокол исследования вместе с последовательностями праймеров (Knowles et al., 2016), или его можно скачать со следующих ресурсов всемирной сети:
http: //www. wrlfmd. org/
http: //bvs. panaftosa. org. br/
|
|
|
