 |
2.2.1. Методика анализа. 2.3. Жидкофазный блокирующий иммуноферментный анализ. 2.3.1. Процедура теста
|
|
|
|
2. 2. 1. Методика анализа
i) ИФА планшеты сенсибилизируют кроличьей антисывороткой, гомологичной используемому антигену, разведенной в карбонатном/биокарбонатном буфере, рН 9, 6, по 50 мкл/лунку, и оставляют на ночь во влажной камере при температуре 4°С.
ii) ИФА планшеты промывают три раза ЗФР.
iii) Затем в каждую лунку ИФА планшетов добавляют 50 мкл антигена вируса ящура, разведенного в блокирующем буфере. (Блокирующий буфер: 0. 05% [вес/объем] Твин 20, 10% [объем/объем] нормальная бычья сыворотка, 5%
[объем/объем] нормальная кроличья сыворотка). Планшеты накрывают и помещают в орбитальный шейкер при 37°С на один час, при постоянном встряхивании.
iv) После трехразового промывания планшетов с помощью ЗФР, в каждую лунку добавляют 40 мкл блокирующего буфера, а затем 10 мкл тестируемой сыворотки (или контрольной сыворотки), получая исходное разведение сыворотки 1/5.
v) Сразу после этого добавляют 50 мкл противоящурной антисыворотки морской свинки, разведенной в блокирующем буфере, получая конечное разведение сыворотки 1/10.
vi) Планшеты накрывают и инкубируют в орбитальном шейкере при 37°С в течение часа.
vii) После трехразового промывания с помощью ЗФР, добавляют 50 мкл конъюгата иммуноглобулина против глобулинов морской свинки (предварительно блокированного посредством инкубации в течение часа при комнатной температуре с равным объемом нормальной бычьей сыворотки), разведенного в блокирующем буфере. Планшеты накрывают и инкубируют в течение часа при 37°С на орбитальном шейкере.
viii) После трехразового промывания планшетов с помощью ЗФР, в каждую лунку добавляют 50 мкл раствора субстрата, содержащего 0. 05% Н2О2 плюс ортофенилендиамин или подходящий альтернативный хромоген.
|
|
|
ix) Реакцию останавливают через 10 минут путем добавления 50 мкл 1М серной кислоты. Планшеты считывают при длине волны 492 нм на спектрофотометре, подсоединенном к компьютеру.
x) Контроли: На каждом планшете две лунки используют для контроля конъюгата (без сыворотки морской свинки), четыре лунки для сильно- и слабо-положительных сывороток, две лунки для отрицательных сывороток, и четыре лунки для 0% конкуренции (без тестируемой сыворотки).
xi) Интерпретация результатов: Для каждой лунки вычисляют процент ингибирования, либо вручную, либо используя подходящую компьютерную программу (100 – [оптическая плотность каждой тестовой или контрольной величины/средняя оптическая плотность 0% конкуренции] х 100%), показывающий степень конкуренции между тестируемой сывороткой и противоящурной антисывороткой морской свинки за антигены вируса ящура на ИФА планшете. Лаборатории должны провести валидацию данного анализа в отношении значения точки разделения, выше которого сыворотки считаются положительными, учитывая следующее: 1) конкретные исследуемые серотипы и штаммы вируса, 2) цель тестирования, 3) тестируемая популяция, используя методы, описанные в Главе 1. 1. 6. Принципы и методы валидации диагностических анализов для инфекционных болезней. В Референтной лаборатории МЭБ в Пирбрайте, для серотипа О, для всех видов животных, в целях демонстрации свободы от инфекции у интактного поголовья, степень ингибирования выше 60%
считается положительным результатом (Paiba et al., 2004). Для обеспечения максимальной чувствительности, например, когда происходит сертификация отдельных животных для международной торговли, диапазон неубедительных результатов может быть установлен между 40 и 60%.
2. 3. Жидкофазный блокирующий иммуноферментный анализ
Антигены получают из отобранных штаммов вируса ящура, выращенных на монослоях клеток ВНК-21. Используют неочищенные супернатанты, которые предварительно титруют в серии двукратных разведений, но без сыворотки. Выбранное конечное разведение - это разведение, которое после добавления равного объема разбавителя (см. ниже) дает абсорбцию в верхней части линейного области титрационной кривой (оптическая плотность приблизительно 1, 5). В качестве разбавителя используют ЗФР, содержащий 0. 05% Твин 20, и феноловый красный индикатор (PBST). Другие реагенты, используемые в тесте, такие же что и в твердофазном конкурентном ИФА. Ниже описана примерная процедура теста. Температура и время инкубации могут варьировать в зависимости от протокола исследования.
|
|
|
2. 3. 1. Процедура теста
i) ИФА планшеты сенсибилизируют кроличьей антисывороткой, гомологичной используемому антигену, в объеме 50 мкл/лунка, и оставляют на ночь во влажной камере при комнатной температуре.
ii) ИФА планшеты промывают три раза с помощью ЗФР.
iii) На многолуночных планшетах с U- образным дном (планшеты носители) готовят двукратные серии каждой тестируемой сыворотки крови в двух повторностях в объеме 50 мкл, начиная с 1/8. В каждую лунку добавляют 50 мкл постоянной дозы вирусного антигена, который гомологичен кроличьей антисыворотке, используемой для сенсибилизирования планшетов, и данные смеси оставляют на ночь при 4°С или инкубируют при 37°С в течение часа. Добавление антигена увеличивает конечное разведение сыворотки до 1/16.
iv) Затем 50 мкл смесей сыворотка/антиген переносят с планшетов-носителей на ИФА планшеты, сенсибилизированные кроличьей сывороткой. Данные планшеты инкубируют при температуре 37°С в течение часа в ротационном шейкере.
v) После промывания в каждую лунку добавляют 50 мкл антисыворотки морской свинки, гомологичной к вирусному антигену, использованному в предыдущем этапе (iv) (предварительно блокированной нормальной бычьей сывороткой и разведенной PBST, содержащем 5% обезжиренное сухое молоко). Затем планшеты инкубируют при температуре 37°С в течение часа в ротационном шейкере.
vi) Планшеты промывают, и в каждую лунку добавляют 50 мкл кроличьего иммуноглобулина против глобулинов морской свинки, конъюгированного с пероксидазой хрена (предварительным блокированного нормальной бычьей сывороткой и разведенного PBST, содержащем 5% обезжиренное сухое
|
|
|
молоко). Планшеты инкубируют при температуре 37°С в течение часа в ротационном шейкере.
vii) Планшеты снова промывают три раза, и в каждую лунку добавляют 50 мкл раствора субстрата, содержащего 0, 05% Н2О2 и ортофенилендиамин или подходящий альтернативный хромоген.
viii) Реакцию останавливают через 15 минут путем добавления 50 мкл 1М серной кислоты. Планшеты считывают при длине волны 492 нм на спектрофотометре, подсоединенном к компьютеру.
ix) Контроли: На каждом планшете должно быть, как минимум, по 4 лунки с сильно положительной, слабо положительной и отрицательной бычьей эталонной сывороткой в конечном разведении 1/32 вместе с эквивалентным количеством лунок контроля реакции (антигена), содержащих только антиген в разбавителе, без сыворотки. При проведении тестов посредством титрования в конечной точке, как минимум на одном планшете каждого цикла исследования должны присутствовать серии двукратных разведений в двух повторностях положительной и отрицательной гомологичной бычьей эталонной сыворотки.
x) Интерпретация результатов: Титры антител выражают в виде 50% титра в конечной точке, т. е. разведения, при котором реакция тестируемой сыворотки дает оптическую плотность равную 50% ингибиции срединной оптической плотности лунок контроля реакции (антигена) (Kä rber, 1931). Срединное значение вычисляют в виде среднего значения двух средних значений лунок с контролем реакции, исключая из вычислений самые высокие и самые низкие значения (альтернативно, можно использовать среднее значение после установления подходящих предельно допустимых показателей в целях контроля вариации между лунками). В целом, сыворотки с титрами равными 1/90 или выше считаются положительными. Титры ниже, чем 1/40, считаются отрицательными. Для сертификации отдельных животных в целях международной торговли, титры выше 1/40, но ниже 1/90 считаются сомнительными, и возможно потребуется отбор дополнительных образцов сыворотки для тестирования; результаты считаются положительными, если второй образец имеет титр 1/40 или выше. Для серологического надзора на уровне стада, как части статистически достоверного серологического обследования, возможно соответствующим значением точки разделения будет 1/90. Титры точки разделения для оценивания иммунологической защиты, предоставляемой вакцинацией, следует устанавливать исходя из опыта по получению результатов теста на иммуногенность при использовании релевантной вакцины и целевых видов животных.
|
|
|
