 |
2.1. Реакция нейтрализации вируса
|
|
|
|
2. 1. Реакция нейтрализации вируса
Количественная микрореакция нейтрализации вируса на наличие антител к вирусу ящура осуществляется с использованием IB-RS-2, BHK-21, клеток почек ягнят и свиней на плоскодонных титрационных микропланшетах для культивирования тканей.
Исходный вирус выращивают в клеточных монослоях и хранят при температуре -20°С после добавления 50% глицерина. (Выявлено, что вирус стабилен в таких условиях в течение, как минимум, одного года). Перед тестированием сыворотки крови инактивируют при температуре 56°С в течение 30 минут. Контрольная стандартная сыворотка крови представляет собой сыворотку крови, отобранную на 21 день выздоровления или после вакцинации. Подходящей средой является полная среда Игла/LYH (сбалансированный солевой раствор Хэнкса с дрожжами, гидролизатом лактальбумина) с HEPES буфером и антибиотиками.
Тест является тестом, проводимым с равными объемами по 50 мкл.
2. 1. 1. Процедура теста
i) Начиная с ¼ разведения, сыворотки крови разводят двукратно, серия разведений по всему планшету, используя, как минимум, два ряда лунок для одной сыворотки крови, предпочтительно четыре ряда, и объем в 50 мкл.
ii) Добавляют предварительно титрованный вирус; каждая единица объема суспензии вируса в 50 мкл должна содержать около 100 TCID50 (50% доза, инфицирующая культуру ткани) в допустимом диапазоне (например, 32-320 TCID50).
iii) Контроли включают стандартную антисыворотку с известным титром, контроль клеток, контроль среды, и титрование вируса для вычисления фактического титра вируса, используемого в данном тесте.
iv) Покрытые планшеты инкубируют при 37°С в течение часа.
|
|
|
v) Клеточную суспензию плотностью 106 клеток/мл готовят в среде, содержащей 10% бычью сыворотку (не содержащую специфических антител) для клеточного роста. В каждую лунку добавляют клеточную суспензию объемом в 50 мкл.
vi) Планшеты герметично запечатывают самоклеющейся лентой и инкубируют при температуре 37°С в течение 2-3 дней. В качестве альтернативы, планшеты можно покрыть неплотно прилегающими крышками и инкубировать в атмосфере с 3-5% углекислым газом при 37°С в течение 2-3 дней.
vii) Микроскопическое считывание возможно спустя 48 часов. На третий день планшеты в заключение фиксируют и, рутинно окрашивают. Фиксацию производят с помощью 10% формальдегида/солевого раствора в течение 30 минут. Для окрашивания планшеты погружают в 0, 05% метиленовый синий в 10% формалине на 30 минут. Альтернативным фиксатором/окрашивающим раствором является раствор сине-черного нафталина (0, 4% [вес/объем] сине-черный нафталин, 8% [вес/объем] лимонная кислота в солевом растворе). Планшеты промывают в водопроводной воде.
viii) В лунках с положительной реакцией (где вирус нейтрализован и клетки остались неповрежденными) наблюдается присутствие окрашенных в синий цвет клеточных слоев; лунки с отрицательной реакцией (где вирус не был нейтрализован) пусты. Титры выражают в виде конечного разведения сыворотки крови, присутствующей в смеси сыворотка/вирус, где 50% лунок защищены (Kä rber, 1931). Результаты теста считаются достоверными, если количество вируса, использованного в одной лунке, находится в диапазоне log10 1, 5-2, 5 TCID50, а показатель положительной стандартной сыворотки крови - в пределах двукратного значения её ожидаемого титра.
ix) Интерпретация результатов тестов может варьировать в зависимости от порогового значения точки разделения положительных/отрицательных результатов Лаборатории должны установить свои собственные критерии, сверяясь со стандартными реагентами, которые можно получить из Референтной лаборатории МЭБ в Пирбрайте. Как правило, титр конечного разведения сыворотки крови в смеси сыворотка/вирус, равный 1/45 или выше, считается положительными. Титр меньше 1/16 считается отрицательным. Для сертификации отдельных животных в целях международной торговли, титры от 1/16 до 1/32 считаются сомнительными, и могут быть запрошены дополнительные образцы сыворотки крови для тестирования, результаты считаются положительными, если второй образец имеет титр 1/16 или выше. При проведении серологического надзора на уровне стада, как части статистически достоверного серологического исследования, возможно соответствующим значением точки разделения будет 1/45. Титры точки разделения для оценки степени иммунологической защиты, предоставляемой вакцинацией, следует устанавливать исходя из опыта по получению результатов теста на иммуногенность при использовании релевантной вакцины и целевых видов животных.
|
|
|
2. 2. Твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ
Описанный метод (Paiba et al., 2004) может быть использован для обнаружения антител к каждому из семи серотипов вируса ящура. В качестве альтернативы антисывороткам морской свинки или кролика, можно использовать подходящие моноклональные антитела, которыми сенсибилизируют ИФА планшеты, в качестве
захватывающих антител, или которые конъюгированы с пероксидазой в качестве детекторных антител (Brocchi et al., 1990). Имеются коммерческие наборы на базе моноклональных антител для серотипа О (Chenard et al., 2003), серотипа А, серотипа Азия-1 и серотипа SAT2 в различных форматах, но со схожими рабочими характеристиками.
Кроличья антисыворотка к 146S антигену одного из семи типов вируса ящура используется в качестве захватывающего антитела в заранее установленной оптимальной концентрации в карбонатном/биокарбонатном буфере, pH 9, 6.
Антигены получают посредством инактивации вирусов, репродуцированных в культуре клеток, с помощью этиленимина, используя процедуры, описанные для производства вакцины. Выбранное конечное разведение представляет разведение, которое после добавления равного объема разбавителя дает абсорбцию в верхней части линейной области титрационной кривой (оптическая плотность приблизительно 1, 5). В качестве растворителя используется ЗФР, содержащий 0, 05% Твин 20, 10% нормальную бычью сыворотку и 5% нормальную кроличью сыворотку и феноловый красный индикатор (блокирующий буфер).
|
|
|
Антисыворотка морской свинки, полученная посредством прививки морских свинок 146S антигеном вируса ящура одного из семи серотипов и предварительно блокированная нормальной бычьей сывороткой, используется в качестве детекторных антител. Заранее определенные оптимальные концентрации готовят в блокирующем буфере, ЗФР, содержащем 0, 05% Твин 20 и 5% сухое, обезжиренное молока (PBSTM).
Кроличий (или овечий) иммуноглобулин против глобулинов морской свинки, конъюгированный с пероксидазой хрена и предварительно блокированный нормальной бычьей сывороткой, используется в качестве конъюгата в заранее определенной оптимальной концентрации в PBSTM блокирующем буфере.
Готовят разведения тестируемых сывороток крови с помощью PBST блокирующего буфера.
Твердофазный конкурентный ИФА имеет более высокую специфичность, но его чувствительность такая же, как у жидкофазного блокирующего ИФА (Mackay et al., 2001; Paiba et al., 2004). Были описаны методы для получения вторичных и рабочих стандартных сывороток (Goris & De Clerq, 2005a), а также для оценки рабочих характеристик анализа методом составления графиков (Goris & De Clerq, 2005b).
|
|
|
