 |
1.3. Методы обнаружения нуклеиновых кислот
|
|
|
|
1. 3. Методы обнаружения нуклеиновых кислот
ОТ-ПЦР может быть использована для амплификации фрагментов генома вируса ящура в диагностических материалах, включая эпителий, молоко, сыворотку крови и пищеводно-глоточные образцы. ОТ-ПЦР обладает чувствительностью, сопоставимой с таковой процедуры выделения вируса, а автоматизированные процедуры повышают количество обрабатываемых образцов (Reid et al., 2003). Также разработаны праймеры для серотипирования (Vangrysperre & De Clerq, 1996). В процессе разработки находятся упрощенные ОТ-ПЦР системы для потенциального использования в полевых условиях (Callahan et al., 2002).
1. 3. 1. ОТ-ПЦР анализ с электрофорезом в агарозном геле
Описана процедура ОТ-ПЦР с электрофорезом в агарозном геле (Reid et al., 2000). Данный ОТ-ПЦР анализ состоит из трех следующих друг за другом процедур: (i) экстрагирование матричной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из
тестируемого или контрольного образца с последующей (ii) ОТ экстрагированной РНК, (iii) ПЦР амплификацией ОТ продукта и (iv) обнаружением ПЦР продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле.
1. 3. 2. Процедура анализа
i) Добавить 200 мкл тестируемого образца к 1 мл реагента для экстрагирования РНК в стерильной пробирке. Хранить при температуре -70°С до тех пор, пока не потребуется для экстрагирования РНК.
ii) Перенести 1 мл раствора из i) в неиспользованную, стерильную пробирку, содержащую 200 мкл хлороформа. Перемешивать на вортексе около 10-15 секунд и оставить при комнатной температуре на 3 минуты.
iii) Центрифугировать в течение 15 минут при 20 000 g.
iv) Перенести 500 мкл водной фазы в неиспользованную, стерильную пробирку, содержащую 1 мкл гликогена (20 мг/мл) и добавить 500 мкл изопропилового спирта (пропан-2-ол). Перемешивать на вортексе в течение нескольких секунд.
|
|
|
v) Оставить при комнатной температуре на 10 минут, затем подвергнуть центрифугированию в течение 10 минут при 20 000 g.
vi) Слить из каждой пробирки супернатант и добавить 1 мл 70% этилового спирта. Перемешивать на вортексе в течение несколько секунд.
vii) Центрифугировать в течение 15 минут при 20 000 g.
viii) Осторожно слить супернатант из каждой пробирки, стараясь не сместить и не утратить осадок после центрифугирования на дне пробирки.
ix) Высушить на воздухе каждую пробирку при комнатной температуре в течение 2-3 минут.
x) Ресуспендировать каждый осадок, добавляя в пробирки 20 мкл воды, не содержащей нуклеазу.
xi) Хранить экстрагированные образцы РНК на льду, если этап ОТ будет проводиться в ближайшее время. В противном случае, хранить при температуре -70°С.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы фенолу/хлороформу экстрагирование РНК можно проводить, используя имеющиеся в продаже наборы на основе лизиса хаотропными солями и аффинности РНК к кремнию.
xii) Для каждого образца, подлежащего анализу, добавляют 2 мкл произвольных гексамеров (20 мг/мл) и 5 мкл не содержащей нуклеазы воды в стерильную 0. 05 мл центрифужную микропробирку. Рекомендуется готовить разведение в большом объеме для всего количества образцов, подлежащих анализу, плюс еще для одного дополнительного образца.
xiii) Добавить 5 мкл РНК, полученной при проведении процедуры экстрагирования, описанной выше, до получения в каждой пробирке объема в 12 мкл. Аккуратно смешать посредством пипетирования вверх/вниз.
xiv) Инкубировать при температуре 70°С в течение 5 минут.
xv) Остудить при комнатной температуре в течение 10 минут.
xvi) В течение 10-минутного инкубационного периода, подготовить ОТ реакционную смесь, описанную ниже, для каждого образца. Приготовить данную реакционную смесь в большом объеме в стерильной 1, 5 мл центрифужной микропробирке для всего количества образцов, подлежащих анализу, плюс еще для одного дополнительного образца.
|
|
|
Буфер для синтеза первой цепи, 5х конц. (4 мкл); альбумин бычьей сыворотки (ацетилированный), 1 мг/мл (2 мкл); dNTPs, 10 мМ смеси каждой из dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1 мкл); DTT, 1 М (0. 2 мкл); обратная транскиптаза вируса мышиного лейкоза Молони, 200 Е/мкл (1 мкл).
xvii) Добавить 8 мкл реакционной смеси к 12 мкл произвольного праймера/РНК смеси. Перемешать посредством осторожного пипетирования.
xviii) Инкубировать при 37°С в течение 45 минут.
xix) Хранить ОТ продукты на льду, если ПЦР амплификация будет проводиться в ближайшее время, в другом случае, хранить при температуре -20°С.
xx) Приготовить ПЦР смесь, описанную ниже, для каждого образца. Рекомендуется готовить смесь в большом объеме для того количества проб, которое подлежит тестированию, плюс один дополнительный образец.
Вода, не содержащая нуклеаз (35 мкл); ПЦР реакциионный буфер, 10х конц. (5 мкл); MgCl2, 50 мМ (1. 5 мкл); dNTPs, 10 мМ смесь каждой из dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1 мкл); праймер 1, 10 пмоль/мкл (1 мкл); праймер 2, 10 пмоль/мкл (1 мкл); Taq-полимераза, 5 единиц/мкл (0. 5 мкл).
xxi) Добавить 45 мкл ПЦР реакционной смеси в лунку ПЦР планшета или центрифужную микропробирку для каждого образца, подлежащего анализу, а затем 5 мкл ОТ продукта до получения итогового реакционного объема в 50 мкл.
xxii) Вращать планшет и пробирки в течение 1 минуты в подходящей центрифуге для перемешивания содержимого каждой лунки.
xxiii) Поместить планшет в термоциклер для ПЦР амплификации и прогнать по следующей программе:
94°С в течение 5 минут: 1 цикл;
94°С в течение 1 минуты, 55°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут: 30 циклов;
72°С в течение 7 минут: 1 цикл.
Возможно, будет необходимо оптимизировать временные периоды и температуры для конкретных ферментов, реагентов и ПЦР оборудования, используемых в отдельных лабораториях.
xxiv) Смешать 20 мкл аликвоты каждого ПЦР реакционного продукта с 4 мкл окрашивающего раствора и нанести на 1, 5% агарозный гель. После электрофореза, положительным результатом считается присутствие полосы, шириной 328 п. н., соответствующей последовательности вируса ящура в 5’ нетранслируемой области генома.
|
|
|
