 |
1.2.2. Процедура анализа. 1.2.3. Тест с использованием устройств с боковым потоком. 1.2.4. Реакция связывания комплемента (РСК)
|
|
|
|
1. 2. 2. Процедура анализа
i) Сенсибилизировать ИФА планшеты с помощью кроличьей антивирусной сыворотки крови в 0, 05 М карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9, 6, по 50 мкл в каждую лунку. В ряды от А до Н добавляют, соответственно, антисыворотки к серотипам O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, Азия 1 и SVDV или VSV (по усмотрению). В странах, расположенных в регионах, где серотипы SAT и Азия-1 никогда не циркулировали, эти серотипы при рутинном исследовании не включают.
ii) Оставить на ночь при температуре 4°С в стационарном положении или поместить в орбитальный шейкер, установленный на 100-120 вращений в минуту при 37°С на один час.
iii) Приготовить суспензию тест-образца (10% суспензия исходного образца или неразбавленная осветленная надосадочная жидкость клеточной культуры).
iv) ИФА планшеты промыть пять раз с помощью ЗФР.
v) На каждом планшете наполнить лунки колонок 4, 8, и 12 50 мкл PBST. Кроме того, добавить 50 мкл PBST в лунки 1, 2 и 3 рядов А-Н на планшете 1. В лунку 1 ряда А на планшете 1 добавить 12, 5 мкл контрольного антигена типа О, в лунку 1 ряда В добавить 12, 5 мкл контрольного антигена типа А; продолжить таким же образом для контрольного антигена типа С, SAT 1, SAT 2, SAT 3, Азия 1 и SVDV или VSV (если целесообразно) по порядку с лунки 1, рядов С-Н. Перемешать разбавитель в лунке 1 рядов А-Н и перенести 12, 5 мкл из лунки 1 в лунку 2 (рядов А-Н), перемешать и перенести 12, 5 мкл из лунки 2 в лунку 3, перемешать и удалить 12, 5 мкл из лунки 3 (ряды А-Н) (это дает серию пятикратных разведений каждого контрольного антигена). Необходимо только менять наконечники пипеток на микропипетке при переходе от одного антигена к другому. Остальная часть планшета может быть заполнена тест-образцом(-ми). Добавить 50 мкл
|
|
|
первого образца в лунки 5, 6 и 7 рядов А-Н, второй образец аналогично разместить в колонках 9, 10 и 11, рядов А-Н.
Если одновременно тестируются больше двух образцов, нужно использовать другой планшет для ИФА следующим образом:
Распределить по 50 мкл PBST в лунки (ряды А-Н) колонок 4, 8 и 12 (колонок контроля буфера). Обратите внимание, что использование контрольных антигенов на этих планшетах не требуются. Данные тест-образцы можно добавлять в объеме 50 мкл в лунки рядов от А до Н колонок 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, соответственно.
vi) Накрыть крышкой и поместить в орбитальный шейкер при 37°С на один час.
vii) Промыть планшеты, наполняя из ЗФР – промыть три раза и затем вылить остатки промывочной жидкости. Промокнуть планшеты до сухого состояния.
viii) Перенести объем в 50 мкл каждого разведения сыворотки крови морской свинки в каждую лунку планшета в соответствующем порядке, например, в ряды А-Н помещают, соответственно, антисыворотки к серотипам O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, Азия 1 и SVDV или VSV (по усмотрению).
ix) Накрыть планшеты крышкой и поместить в орбитальный шейкер. Инкубировать в течение часа при 37°С.
x) Планшеты снова промыть три раза, и в каждую лунку добавить 50 мкл кроличьего иммуноглобулина против глобулинов морской свинки, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшеты инкубируют в течение часа при 37°С в ротационном шейкере.
xi) Планшеты снова промыть три раза, и в каждую лунку добавить 50 мкл раствора субстрата, содержащего 0, 05% Н2О2 плюс ортофенилендиамин или подходящий альтернативный хромоген.
xii) Произвести остановку реакции через 15 минут посредством добавления 50 мкл 1, 25 М серной кислоты. Планшеты считывать при длине волны 492 нм на спектрофотометре, присоединенным к компьютеру.
1. 2. 3. Тест с использованием устройств с боковым потоком
В продаже имеются устройства с боковым потоком (LFD) для обнаружения антигенов вируса ящура (Ferris et al., 2009), но МЭБ еще не получило валидационное досье для этих тестов. Как только досье буде получено, производитель может подать заявку о включении их в реестр тестов МЭБ.
|
|
|
1. 2. 4. Реакция связывания комплемента (РСК)
В целом, предпочтительным является ИФА, а не РСК, потому что он наиболее чувствителен и не подвержен воздействию про- или анти- комплементарных факторов (Ferris & Dawson, 1988). Если ИФА реагенты не доступны, или если
необходимо провести субтипирование, можно провести РСК следующим образом:
Протокол проведения РСК50% в пробирках, широко используется в Южной Америке для типирования, субтипирования и для определения серологического родства (r-показатель), и осуществляется следующим образом: 0, 2 мл антисыворотки к каждому серотипу вируса ящура, разведенной до заранее определенного оптимального разведения в разбавителе в виде вероналового буфера (VBD) или в борат-солевом растворе (BSS), помещают в отдельные пробирки. К полученному раствору добавляют 0, 2 мл суспензии тест-образцов, а затем 0, 2 мл разведения комплемента, содержащего 4 единицы комплемента. Данную тест-систему инкубируют при 37°С в течение 30 минут, а затем добавляют 0, 4 мл 2% стандартизированных эритроцитов барана (SRBC) в VBD или BSS, сенсибилизированных кроличьими анти-SRBC. Реагенты инкубируют при 37°С в течение еще 30 минут, и пробирки впоследствии центрифугируют и считывают. Образцы с гемолизом менее 50% считаются положительными.
Имеются и используются другие протоколы, где исследование проводится на микропланшетах следующим образом: антисыворотки к каждому из семи типов вируса ящура разбавляют вероналовом буфером (VBD) с шагом в 1, 5 кратное разведение, начиная с первоначального 1/16 разведения, чтобы оставить 25 мкл последовательных разведений антисыворотки в U- образных лунках от края до края титрационного микропланшета. В них добавляют 50 мкл трех единиц комплемента, а затем 25 мкл суспензии(-зий) тест образца(-ов). Данную тест-систему инкубируют при 37°С в течение 1 часа, затем добавляют 25 мкл 1, 4% стандартизированных бараньих эритроцитов (SRBC) в вероналовом буферном растворе (VBD), сенсибилизированных с помощью 5 единиц кроличьих анти- SRBC. Реагенты инкубируют при 37°С в течение следующих 30 минут, планшеты впоследствии центрифугируют и считывают. Включают соответствующие контроли для тестируемой суспензии(-зий), антисывороток, клеток и комплемента. РСК титры выражают в виде величины, обратной разведению сыворотки, продуцирующему 50% гемолиз. РСК титр, составляющий ≥ 36, считается положительной реакцией. Значение титра, эквивалентное 24, следует подтверждать повторным тестированием антигена, который был амплифицирован посредством пассирования в культуре ткани.
|
|
|
|
|
|
