 |
2.4. Тест для обнаружения антител к неструктурным белкам
|
|
|
|
2. 4. Тест для обнаружения антител к неструктурным белкам
Антитела к экспрессированным рекомбинантным неструктурным белкам вируса ящура (например, 3А, 3В, 2В, 2С, 3АВС), можно измерить при помощи ИФА различных форматов или иммуноблотинга. В этих ИФА используются либо очищенные антигены, абсорбированные непосредственно на микропланшеты, либо используются поликлональные или моноклональные антитела для захвата специфических антигенов из полуочищенных препаратов (Bergman et al., 2000; De
Diego et al., 1997; Mackay et al., 1997; Sorensen et al., 1998). Метод скрининга показателей, используемый в Panaftosa, подробно описан ниже. Было выявлено, что другие виды непрямого и конкурентного ИФА, обнаруживающие антитела КРС к 3АВС, обладают равнозначной диагностической эффективностью (Brocchi et al., 2006). Результаты этого же исследования подтверждают предварительные данные, полученные Panaftosa, которые позволяют предположить, что диагностическая эффективность этих тестов сходна при их применении для КРС, овец и свиней.
2. 4. 1. Непрямой иммуноферментный анализ
a) Подготовка рекомбинантных антигенов
См. Раздел В. 2. 4. 2. Иммуноферментный элеткроблоттинг
b) Процедура теста
i) Микропланшеты сенсибилизируют с помощью 1 мкг/мл слитого антигена 3АВС в карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9, 6 (по 100 мкл в лунку) в течение ночи при 4°С. Антиген 3АВС экспрессирован и очищен, как указано для тестов методом иммуноферментного электроблотинга (Neizert et al., 1991).
ii) Планшеты промывают шесть раз с помощью ЗФР, рН 7, 2, дополненным 0, 05% Твин 20 (PBST).
iii) Тестируемые сыворотки (по 100 мл в лунке) добавляют в разведении 1/20 в блокирующем буфере, состоящем из ЗФР, 0, 05% Твина 20, 5% обезжиренного сухого молока, 10% лошадиной сыворотки и 0, 1% лизата Escherichia coli. Каждый планшет содержит набор сильно и слабо положительных и отрицательных контролей, калиброванных по международным стандартным сывороткам, описанным ниже.
|
|
|
iv) Планшеты инкубируют в течение 30 минут при 37°С и промывают шесть раз с помощью PBST.
v) Производят оптимальное разведение конъюгированного с пероксидазой хрена кроличьего антивидового IgG в блокирующем буфере, затем добавляют по 100 мкл в лунку, и планшеты инкубируют в течение 30 минут при 37°С.
vi) После шестиразового промывания, каждую лунку заполняют 100 мкл 3’3’, 5’5’- тетраметилбензидином плюс 0, 004% (вес/объем) H2O2 в фосфатном/цитратном буфере, рН 5, 5.
vii) Реакцию останавливают после 15 минутной инкубации при комнатной температуре, добавляя 100 мкл 0, 5М H2SO4. Показатели поглощения считывают при длине волны 450 нм и 620 нм для поправки на фон.
viii) Интерпретация результатов: Результаты тестов выражают в виде процента положительности по отношению к сильно положительному контролю [(оптическая плотность тестовых или контрольных
лунок/оптическая плотность сильно положительного контроля) х 100] или, альтернативно, в виде тест/контроль индекса относительно контроля точки разделения (например, положительная пороговая величина). Анализ спектра антител к NSP по уровням реактивности в стадах, наряду со стратификацией возраст/вакцинация, способствует интерпретации статуса стада по инфекции в вакцинированных популяциях (Bergmann et al., 2003). Необходимо определить значения точек разделения в тестах вместе с зон сомнительных значений или без них с учетом цели тестирования и предполагаемой целевой популяции. Образцы, показавшие не позволяющие сделать окончательный вывод результаты, можно протестировать повторно с помощью подтверждающих тестов, иммуноферментного электроблоттинга или ИФА с вторичными неструктурными белками (принимая во внимание условную зависимость между двумя тестами). При разработке программы серологического надзора следует учитывать чувствительность и специфичность всей тест-системы. Хотя NSP ИФА и не является подходящим тестом для сертификации животных перед их перемещением, он может быть важным вспомогательным средством в обстоятельствах, когда серотип или подтип вируса в стране происхождения неизвестны.
|
|
|
2. 4. 2. Иммуноферментный электроблоттинг (EITB)
Иммуноферментный электроблотинг (EITB) широко применяется в Южной Америке, в качестве подтверждающего теста для вышеописанного метода скрининга. Дополнительную информацию можно получить в Референтной лаборатории МЭБ, Panaftosa, Панамериканская организация здравоохранения/Всемирная организация здравоохранения (PAHO/WHO).
a) Подготовка тестовых полосок, содержащих рекомбинантные антигены
i) Пять полученных с помощью методов биоинженерии неструктурных белков вируса ящура, 3A, 3B, 2C, 3D и 3ABC эксперссируют в E. coli C600 посредством термоиндукции. Полипептид 3D экспрессируют в его полной форме (McCullough et al., 1992), тогда как остальные белки получают в виде слияний с N-терминальной частью гена полимеразы MS-2 (Strebel et al., 1986).
ii) Экспрессированную полимеразу очищают на фосфоцеллюлозе, а затем используют колонки поли (U)-Сефарозы. Слитые белки 3A, 3B, 2C и 3ABC очищают посредствам последовательного экстрагирования бактериальных экстрактов с увеличением концентрации мочевины. Фракцию 7М, содержащую слитые белки, подвергают дополнительной очистке посредством препаративного 10% SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Полосу слитых белков вырезают из геля и подвергают электроэлюированию (McCullough et al., 1992).
iii) Смесь, содержащую 20 нг/мл каждого одного из очищенных рекомбинантных полипептидов, сепарируют на 12, 5% SDS-PAGE и электрофоретически перемещают на нитроцеллюлозу (McCullough et al., 1992).
|
|
|
