 |
Диагностика инфекции Helicobacter pylori
|
|
|
|
Для диагностики HP-инфекции применяются различные методы: гистологический, цитологический, бактериологический, биохимический, серологический, радионуклидный, иммунологический и молекулярный.
Все они делятся на прямые и косвенные, а также на инвазивные и неин-вазивные. С помощью прямых методов выявляется сам HP (цитологическое, гистологическое исследование, бактериологический метод, иммуногистохими-ческий, полимеразная цепная реакция (ПЦР); косвенные методы основаны на определении следов пребывания HP в организме (уреазные тесты с гастроби-оптатами, радионуклидный уреазный дыхательный тест, гелик-тест, серологические методы).
Инвазивные методы требуют проведения эндоскопии с прицельной биопсией (гистологический, цитологический, бактериологический, уреазный тест с гастробиоптатом, ПЦР с гастробиоптатом), для неинвазивных методов эндоскопия не нужна: для серологических исследований используются кровь, пробы выдыхаемого воздуха для дыхательного уреазного теста, зубной налет, слюна, кал для ПЦР.
В настоящее время наиболее часто применяются гистологический и цитологический методы.
Гистологический метод
Гистологическое исследование биоптатов слизистой желудка считается "золотым стандартом" диагностики HP - инфекции. При микроскопическом исследовании препарата используются различные окраски: по Грамму, Гимзе, Генте, Вартину-Старри, толуидиновым синим. Для получения достоверных результатов при проведении гистологического исследования требуется, по меньшей мере, два биоптата слизистой желудка - из антрального отдела и тела желудка. Отбор материала осуществляется из наиболее измененных участков, но не из дна эрозий и язв. Основным преимуществом данного метода является оценка состояния слизистой оболочки желудка, а именно - степени и характера воспалительной инфильтрации, активности гастрита, наличия атрофии и метаплазии.
|
|
|
Для гистологического метода разработана количественная оценка степени обсеменения HP: до 20 в поле зрения при увеличении в 630 раз - слабая, до 50 - средняя, более 50 - высокая. Недостатками гистологического метода являются необходимость наличия морфологической лаборатории, относительно высокая стоимость, а также возможность получения ложноотрицательных результатов. При обработке гастробиоптата с его поверхности отмывается слой слизи, в котором и располагается HP, в связи с чем возможно получение заниженных данных. Разработаны методики, позволяющие уменьшить отмывание слизи (фиксация в смеси Карнуа, добавление в фиксатор таниновой кислоты, укрывание поверхности биоптата слоем агарового геля), но их использование не позволяет полностью решить эту проблему. Применение цитологического исследования мазка-отпечатка, который не подвергается обработке жидкостями, дает более достоверные результаты. Если считать обсемененность в мазке за 100%, то в гистологическом препарате, полученном из того же биоптата, она существенно снижается - от 0 до 25%. В связи с этим следует подчеркнуть, что по сравнению с цитологическим и уреазным Де-нол-тестом гистологический метод наименее надежен.
Цитологический метод
Для микроскопического выявления HP чаще всего используются мазки-отпечатки люминальной поверхности гастробиоптатов (touch cytology). Помимо отпечатков, применяют и другие варианты цитологического исследования: раздавленные препараты (crush cytology) и исследование слоя слизи с поверхности СОЖ, полученного с помощью специальной щеточки (brush cytology). Цитологический метод относительно недорогой, быстрый, не требует сложного оборудования, к тому же более чувствителен, чем гистологический. Он позволяет по клеточным элементам в препарате оценить, помимо наличия HP, активность воспаления, метаплазию, дисплазию, но не дает представления о структуре слизистой оболочки. Мазок-отпечаток (touch cytology) - наиболее часто используемый вариант цитологического исследования, имеет существенный недостаток: практически всегда количество полученного материала недостаточно для исследования. Издержки crush cytology - обилие клеточных элементов, среди которых трудно выделить бактерии. Наилучшие результаты дает brush cytology, причем взятие слизи из нескольких участков слизистой желудка (лучше всего не менее 4 проб из каждого отдела желудка) делает данный метод еще более эффективным.
|
|
|
При анализе различных методов окраски наилучшие результаты позволяет получить применение акридинового оранжевого с последующей микроскопией в люминесцентном микроскопе и окраска по Грамму. Оптимальной является окраска по Грамму, которая позволяет дифференцировать кокковые формы HP от других кокков и не требует наличия люминесцентного микроскопа.
Применение brush cytology, забор слизи не менее, чем из четырех участков антрального отдела и тела желудка, и окраска по Грамму позволяют значительно повысить чувствительность и специфичность цитологического метода диагностики хеликобактерной инфекции.
Бактериологический метод
Бактериологический метод предполагает выделение чистой культуры HP, позволяет определить штамм и чувствительность микроорганизма к антибиотикам, делает возможным хранение полученных культур, благодаря чему дифференцируются случаи рецидивирования, реинфицирования и суперинфици-цирования. Для бактериологического исследования используют гастробиоптаты, которые после забора немедленно помещают в специальные транспортные среды и в течение суток доставляют в микробиологическую лабораторию. Затем производят посев на питательные среды (шоколадный, кровяной агар с добавлением экстракта сердца или мозга, мясо-печеночно-пептонный агар, среда Скирроу с добавкой антибиотиков) и инкубируют в микроаэрофильных условиях при содержании кислорода не более 5% при температуре 37°С 5-10 суток. HP образует мелкие, округлые, прозрачные колонии с гладкой поверхностью или сплошную прозрачную пленку. Существует методика полуколичественной оценки обсемененности слизистой HP в зависимости от числа колоний микроорганизмa: до 10 колоний в одной чашке (1+), 10-20 колоний (2+), 20-50 колоний (3+), более 50 (4+). Затем проводится микроскопическое и биохимическое исследование полученной культуры. Недостатки бактериологического метода: сложность, необходимость наличия микробиологической лаборатории и высокая стоимость, из-за чего данный метод применяется, в основном, в научно-исследовательской работе.
|
|
|
Биохимический метод
Биохимический метод (быстрый уреазный тест) основан на выявлении уреазы, продуцируемой HP. Гастробиоптат помещают в среду, содержащую мочевину и индикатор. Уреаза разлагает мочевину на аммоний и углекислый газ, аммоний вызывает сдвиг рН среды в щелочную сторону, что меняет цвет индикатора. Существуют различные уреазные тесты (кампи-тест, CLO-тест, Де-нол-тест и др.). Их достоинствами являются простота применения, относительно низкая стоимость и быстрое получение результата. К примеру, CLO-тест при наличии HP-инфекции дает положительный результат через 20 минут в 75% случаев, через 24 часа - в 95% случаев. Результаты CLO-теста идентичны результатам дыхательного теста с мочевиной и морфологического исследования гастробиоптата. При положительном ответе нет необходимости применения других методов выявления HP. Недостаток биохимического метода в том, что в данном гастробиоптате может не обнаруживаться HP, что обусловливает получение ложноотрицательных результатов. Для повышения чувствительности рекомендуется брать два и более (до 4) фрагмента СОЖ. Возможны ложноположительные результаты, вызванные наличием в слизистой других микроорганизмов, обладающих уреазной активностью.
Наличие HP можно установить путем определения уровня мочевины и аммиака в желудочном соке. Пробы считаются положительными при содержании мочевины менее 1 ммоль/л или уровне аммиака более 3 ммоль/л: чувствительность и специфичность этих методов составляет, соответственно, 92% и 88%.
|
|
|
Радионуклидный метод
Радионуклидный метод (уреазный и дыхательный тесты, urea breath test) также основан на уреазной активности HP. Пациенту дается пробный завтрак с мочевиной, меченной изотопами углерода (радиоактивным углеродом-14 или нерадиоактивным углеродом-13). Уреаза, вырабатываемая хеликобактером, разлагает мочевину на углекислый газ и аммиак, а углекислота, меченная изо- топами углерода, выводится с выдыхаемым воздухом. Материалом для исследования служат пробы выдыхаемого воздуха.
Радионуклидные тесты неинвазивны, редко дают ложноотрицательные результаты, так как позволяют судить обо всей СОЖ, а не об отдельном ее участке. Преимущество их, по сравнению с серологическими методами, состоит в выявлении наличия HP в слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки, а не предшествовавшего инфицирования. В редких случаях возможны ложноположительные результаты, связанные с наличием других продуцентов уреазы. Ложноотрицательные результаты могут быть получены при применении антибиотиков и антисекреторных препаратов, в связи с чем прием данных лекарственных средств следует прекратить, по меньшей мере, за 10 дней до постановки дыхательного теста.
При использовании углерода-14 наличие индикаторного изотопа определяется сцинтилляционным счетчиком. В связи с использованием радиоактивного изотопа данный метод имеет ряд ограничений: он не применяется для обследования беременных, детей, для повторного обследования, а также в тех случаях, когда пробы отбираются не в лаборатории и требуется их перевозка. Хотя применение нерадиоактивного углерода-13 лишено этих недостатков, однако для регистрации индикаторного изотопа в выдыхаемом воздухе требуется дорогостоящий и сложный в эксплуатации масс-спектрометр. В настоящее время разработана методика диодной лазерной спектроскопии, результаты которой хорошо коррелируют с данными масс-спектрометрии. Применение лазерной диагностики позволяет упростить и удешевить уреазный дыхательный тест с углеродом-13. Другой модификацией этого метода, дающей возможность обойтись без масс-спектрометра, является изотоп-селективная недиспергирующая инфракрасная спектрометрия.
К неинвазивным методам, принцип действия которых основан на анализе аммиака в выдыхаемом воздухе, относятся такие дыхательные тесты, как "Аэротест" и Гелик-тест. "Аэротест" оценивает фоновую концентрацию аммиака в выдыхаемом воздухе, которая, кроме HP, зависит от множества других факторов. В связи с этим "Аэротест" имеет низкую чувствительность и специфичность. Гелик-тест - неинвазивный метод, основанный на оценке роста концентрации аммиака в воздухе ротовой полости после приема обычной мочевины. Гелик-тест прост в применении, дешев, не требует применения сложного оборудования, имеет довольно высокую чувствительность и специфичность.
|
|
|
