Реакции осаждения белков.  Краткие теоретические основы работы.  Получение солевой вытяжки белка.  Диализ солевой вытяжки мышечной ткани

Реакции осаждения белков

1. Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

В три сухие пробирки наливают по 1-2 мл концентрированных азотной, соляной и серной кислот. Затем, наклонив пробирку, по стенке наливают в нее из пипетки по 0, 5 мл раствора белка так, чтобы он не смешивался с кислотой. В месте соприкосновения появляется белый аморфный осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший в пробирке с азотной кислотой, увеличивается, а осадки в двух других пробирках растворяются в избытке кислот.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимое осаждение белка, обусловленное как дегидратацией белковых молекул, так и денатурацией белка.

2. Осаждение трихлоруксусной кислотой.

К 2-3 мл раствора белка прибавляют несколько капель 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Наблюдается выпадение осадка белка. Трихлоруксусной кислота является чувствительным и специфическим реактивом на белок, т. к. осаждает только белки и не осаждает продукты распада, что используется для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови).

3. Осаждение фенолом и формалином.

В две пробирки, содержащие по 1-2 мл раствора белка, добавляют равные объемы в первую пробирку насыщенного водного раствора фенола, во вторую – раствор формалина. В обеих пробирках выпадает осадок белка. От действия фенола осадок выпадает быстрее.

4. Осаждение солями тяжелых металлов.

Соли тяжелых металлов (ртути, свинца, меди, серебра и др. ) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Но некоторые из таких осадков (например, с солями меди, свинца, цинка) растворяются в избытке осадителя вследствие адсорбции ионов поверхностью белковых частиц: в результате белковые частицы приобретают заряд и снова растворяются (адсорбционная пептизация). К 1-1, 5 мл раствора белка прибавляют по каплям раствор соли. Выпадает хлопьевидный осадок.

Контрольные вопросы:

1. Что такое белки?

2. Перечислите цветные реакции на белки.

3. Как связаны между собой молекулы аминокислот в белке?

4. Напишите тетрапептид, состоящий из различных аминокислот.

5. Перечислите аминокислоты, содержащие в своем составе ароматичес­кое кольцо.    

6. Напишите формулы аминокислот, содержащих серу.

7. Укажите принципы классификации аминокислот. Приведите примеры.

8. Перечислите существующие структуры белков. В чем состоит их
отличие?

9. Как обозначаются концы полипептидной цепи?

 

Р абота № 2. Разделение альбуминов и глобулинов                                                                                                                                    методом диализа и высаливания.

                                  Ход работы:

 Краткие теоретические основы работы

Альбумины и глобулины являются наиболее распространенными в природных объектах белками. Обычно они встречаются вместе, и отде­ление их друг от друга основано на различной их растворимости в воде и различной высаливаемости минеральными солями.

Альбумины растворимы в воде и крепких растворах солей (осаждаются лишь при более чем 50%-ном насыщении раствора солью), а глобулины растворимы только в растворах солей средней концентра­ции (8-15%-ных). В растворах с более высокой и более низкой концентрацией соли растворимость глобулинов уменьшается.

 

 Получение солевой вытяжки белка

10 г измельченного фарша настаивают при помешивании в течение 10-15 мин. с 40-50 мл 10%-ного раствора хлорида натрия. Образуется однородная полужидкая масса, которую фильтруют через двойной слой марли. Первые мутные капли фильтрата сливают снова на фильтр и повторно фильтруют до получения фильтрата без взвешенных в нем частиц. Фильтрование идет медленно. Получают около 15-20 мл про­зрачного опалесцирующего окрашенного в розовато-красный цвет рас­твора. В полученной солевой вытяжке белка содержатся глобулины и альбумины, которые далее разделяют методом диализа или высалива­ния.

 Диализ солевой вытяжки мышечной ткани

Метод диализа основан на неспособности крупных белковых частиц проникать сквозь поры полупроницаемых перепонок (искусственные коллоидные и целлофановые мембраны и естественные животные и растительные перепонки), тогда как другие молекулы и ионы легко проходят через них. Методом диализа пользуются для очистки раство­ров высокомолекулярных соединений от солей и других веществ.

Белковый раствор, очищенный этим методом, называется диализированным. Приборы, служащие для диализа, называются диализаторами. Прос­тейшим диализатором может быть мешочек целлофана или коллодия, помещенный в стакан с дистиллированной водой. Для более полного осуществления диализа вода в стакане должна быть проточной или пе­риодически заменяться свежей.

Изготовление диализатора

Вырезают из целлофана круг диаметром 9-12 см. Складывают его в форме мешочка, вставляют в отверстие стеклянную трубку (длиной 5-6 см и диаметром 0, 5-0, 8 см) так, чтобы верхний конец трубки выступал из мешочка на 2-3 см, а нижний был бы погружен внутрь на 1/3 ме­шочка. Мешочек туго завязывают на трубке шнурком. До работы диа­лизатор следует хранить наполненным водой и погруженным с помо­щью держалки для пробирок в стакан с водой. Мешочек должен быть подвешен так, чтобы он не касался стенок и дна стакана. Перед работой воду из диализатора выливают.

С помощью воронки с тонко оттянутым носиком вливают в диализа­тор 10 мл (не более половины объема мешочка) полученного фильтрата солевой вытяжки и погружают мешочек в литровый стакан с дистилли­рованной водой. Через 5-10 мин. отбирают пипеткой немного воды из стакана и убеждаются в наличии там хлорид-ионов (реакция с раство­ром нитрата серебра) и в отсутствии белка (биуретовая реакция на белки). Сменив воду в стакане, если реакция на хлорид-ионы ярко вы­ражена, продолжают диализ, время от времени проверяя реакцию на хлорид-ионы и белок и меняя воду через каждые 5-10 мин.

Через 1, 5-2 ч проба на хлорид-ионы становится отрицательной или очень слабой. Это свидетельствует о завершении диализа, т. е. о почти полной диффузии соли из диализатора в наружный раствори­тель. В мешочке к этому времени прозрачный ранее фильтрат мутнеет вследствие выпадения в осадок глобулинов, не растворимых в дистилли­рованной воде.

Мешочек вынимают из стакана и содержимое его отфильтровывают через бумажный фильтр. На фильтре остаются глобулины, в фильтрат переходят альбумины. Проделывают биуретовую реакцию и доказы­вают наличие обоих белков в осадке и фильтрате.

Для осаждения альбуминов к фильтрату добавляют порошкообраз­ный сульфат аммония до насыщения раствора. При таких условиях альбумины выпадают в осадок. Последний отфильтровывают через сухой бумажный фильтр. При полном насыщении сульфатом аммония в растворе не остается белка, в чем можно убедиться, проведя биуретовую реакцию на белки с небольшой порцией фильтрата (привести уравнение реакции).

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: