 |
Работа № 5. Выделение казеина из молока и определение его изоэлектрической точки
|
|
|
|
Контрольные вопросы.
1. Что такое гидролиз белка и как его производят?
2. Как установить конец гидролиза белка?
3. Каков принцип и химизм формолового титрования?
4. Написать тетрапептид, состоящий из различных аминокислот и реакцию гидролиза.
5. Какое применение имеют белковые гидролизаты в лечебной практике?
6. Соедините аминокислоты с образованием пептидных связей. Напишите трипептид, тетрапептид состоящий из различных аминокислот и дайте им названия.
7. Как различают белки по форме их молекул?
8. Что понимают под первичной структурой белка? Какие связи формируют эту структуру?
9. Что представляет собой вторичная структура белка? Какие связи ее формируют?
10. Что понимают под третичной структурой белка? Какие связи участвуют в ее формировании?
11. Какими методами изучают структуру белковой молекулы?
Работа № 5. Выделение казеина из молока и определение его изоэлектрической точки
Реактивы: Оборудование:
молоко снятое, стакан химический (200 мл) – 2 шт.,
уксусная кислота, 0, 1%-ный р-р, пробирки – 5 шт.,
уксусная кислота, 0, 1 Н р-р цилиндр мерный (50 мл),
карбонат натрия, 0, 1%-ный р-р, пипетка с делениями (10 мл),
спирт этиловый, воронка, стеклянная палочка,
эфир диэтиловый, стакан химический (50 мл),
хлороформ, ступка с пестиком,
казеин – 0, 2 г, фильтры бумажные,
|
|
|
уксуснокислый натрий 0, 1 Н р-р, колба мерная (200 мл),
пробирки, чашка Петри, бюксы,
бюретки – 2 шт.,
водяная баня, плитка.
Ход работы:
1. Краткие теоретические основы работы
Казеиноген (казеин) молока относится к сложным белкам фосфопротеидам и содержит все незаменимые аминокислоты и фосфорную кислоту. В молоке казеиноген представлен растворимой кальциевой солью. В организм вместе с казеином поступают элементы кальций и фосфор.
Эфирная связь в молекулах фосфопротеидов осуществляется благодаря присоединению остатков фосфорной кислоты к гидроксильной группе серина или треонина:
NH2-CH(CH2OH)-COOH + H3PO4 = H2O + NH2-CH(COOH)-CH2-O-PO3H2
фосфосерин в казеине
2. Выделение казеина из молока
Казеин выделяют чаще всего путем подкисления молока, т. е. методом, введенным еще в начале 19 века Г. Я. Мульдером. Считают, что казеин содержится в молоке в виде казеиногена, который в процессе выделения превращается в казеин.
30 мл снятого молока разбавляют четырьмя объемами воды в стакане на 200 мл и при перемешивании добавляют к нему по каплям концентрированный раствор уксусной кислоты до прекращения выделения осадка казеина. Необходимо избегать избытка кислоты, т. к. казеин растворяется в нем. Казеин отфильтровывают, промывают водой и для очистки от жиров и других веществ растворяют в 0, 1%-ном растворе карбоната натрия. Казеин растворяется, жир остается во взвешенном состоянии. Смесь фильтруют через влажный фильтр, при этом жир остается на фильтре.
|
|
|
Фильтрат, содержащий натриевую соль казеина, снова осаждают уксусной кислотой. Осадок казеина отфильтровывают, отжимают между листами фильтровальной бумаги по возможности досуха и растирают для обезвоживания в ступке со спиртом (15-20 мл). затем казеин встряхивают в большой пробирке для удаления жира сначала с эфиром, а затем с 20 мл смеси спирта с хлороформом (1: 1). Полученный чистый казеин после высушивания на воздухе представляет собой белый порошок.
3. Определение изоэлектрической точки казеина
Являясь амфотерными электролитами, белки диссоциируют с образованием как положительно, так и отрицательно заряженных групп. При определении рН среды можно добиться такого соотношения ионизированных групп, при котором белковый раствор наименее устойчив, и белок выпадает в осадок. Испытав поведение белка при различных концентрациях водородных ионов в растворе, находят значение рН среды, соответствующее изоэлектрической точке белка.
В пять пробирок приливают из бюретки следующие количества 0, 1 Н раствора уксусной кислоты: в первую – 0, 25 мл; во вторую – 0, 5 мл; в третью – 1, 0 мл; в четвертую – 2, 0 мл и в пятую – 4, 0 мл. Из другой бюретки в той же последовательности в каждую пробирку прибавляют 8, 75; 8, 5; 8, 0; 7, 0 и 5, 0 мл воды. После добавления раствора казеина в ацетате натрия значения рН в полученных смесях будут равны 5, 3; 5, 0; 4, 7; 4, 4 и 4, 1 соответственно.
Готовят 0, 1%-ный раствор казеина следующим образом: 0, 2 г казеина растворяют при небольшом нагревании на водяной бане в 5 мл 0, 1 Н раствора ацетата натрия и доводят полученный раствор до объема 200 мл раствором ацетата натрия той же концентрации.
В каждую пробирку приливают пипеткой по 1 мл раствора казеина и наблюдают за степенью помутнения раствора в них. Там, где помутнение максимально, рН раствора соответствует изоэлектрической точке белка. Найденное значение рН заносят в рабочий журнал.
Тема ФЕРМЕНТЫ
Работа № 6. Исследование свойств амилазы слюны
Реактивы: Оборудование:
Дистиллированная вода мерный цилиндр (50 мл),
|
|
|
стакан (150-250 мл) – 2 шт.
воронка для фильтрования,
бумага фильтровальная
Ход работы:
Рот ополаскивают 2-3 раза водой для удаления остатков пиши, отмеряют цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течение 3-5 мин. в несколько приемов. Собранную жидкость (примерно 50-60 мл) фильтруют через вату, и фильтрат используют для работы.
|
|
|
