Высаливание мышечного белка. Контрольные вопросы. Работа № 3.  Кислотный гидролиз простого белка. Работа №4. Формоловое титрование по-Серенсену.

Высаливание мышечного белка

Разделение белков солевой вытяжки осуществляют также методом высаливания, основанным на способности альбуминов и глобулинов осаждаться при различной концентрации солей.

а) Высаливаниебелков сернокислым аммонием

К солевой вытяжке, полученной из мышечной ткани, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Выпадает осадок глобулинов. Раствор фильтруют и фильтрат насыщают, добавляя сульфат аммония. Выпадает осадок альбуминов.

б) Высаливание белков хлористым натрием

Ксолевой вытяжке прибавляют тонко измельченный порошок NаСl до полного насыщения раствора. Через несколько минут появляется осадок глобулинов, который отфильтровывают.

К фильтрату, содержащему альбумин, прибавляют по каплям 1%-ный раствор уксусной кислоты; в слабокислой среде происходит осаждение альбумина. Через несколько минут альбумин отфильтровывают, а фильтрат проверяют на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции.

Для составления отчета отмечают положительный результат осажде­ния белков плюсом, а отрицательный - минусом. Результаты работы заносят в таблицу:

Осаждение белков высаливанием

Применяемый р-р белка и наз­вание белковых фракций.	Что осаждается в насыщенном     р-ре NaCl.	Что осаждается в слабокислой среде после высаливания NaCl.	Что осаждается в насыщенном р-ре (NH4)2SO4

 

Контрольные вопросы

1. Чем обусловлены реакции осаждения белков?

2. При каких температурах возможно осаждение белков?

3. Перечислите белки основного и кислого характера.

4. Что такое изоэлектрическая точка и почему она различна для разных белков?

5. Что такое обратимое и необратимое осаждение белков?

6. Что такое денатурация белка?

7. На чем основана классификация белков?

8. Что такое высаливание белка?

9. Какова форма белковых молекул?

 

 

        Работа № 3.    Кислотный гидролиз простого белка

При кислотном гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные пептиды, затем на низкомолекулярные пептиды, дипептиды и, наконец, на аминокислоты.

NH₂-CH(R₁)-CO-NH-CH(R₂)-CO…. ….. -NH-CH(R_n)-COOH + ( n-1) H₂O =

 

= NH₂-CH(R₁)-COOH + NH₂-CH(R₂)-COOH + ……+ NH₂-CH(R_n)-COOH

 

Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильником в присутствии соляной или серной кислоты.

   Реактивы:                                              Оборудование:

соляная кислота, конц.,                         круглодонная колба с воздушным

едкий натр, 10%-ный р-р,                           холодильником     

сульфат меди, 1%-ный р-р,

раствор яичного белка

Ход работы:

     1. Кислотный гидролиз белка

Отмеривают в круглодонную колбу 20 мл раствора яичного белка и 5 мл конц. HCl (удельный вес  1, 18). Колбочку закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и закрепляют на штативе с асбестовой сеткой. Содержимое колбы кипятят под тягой 45 или 90 мин.

2. Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при помощи биуретовой реакции.

В процессе гидролиза проделывают биуретовую реакцию с несколькими каплями предварительно нейтрализованного гидролизата.

К 5 каплям водного раствора белка прибавляют 3 капли 10%-ного раствора едкого натра и 1 каплю раствора сернокислой меди и перемешивают. Содержимое приобретает сине-фиолетовый цвет.

Промежуточные продукты распада белка – пептоны – при проведении биуретовой реакции дают розовое или красное окрашивание, белки – сине-фиолетовое. По окончании гидролиза гидролизат используют для следующей работы.  

Работа №4. Формоловое титрование по-Серенсену.

При гидролизе белка в следствие разрыва пептидных связей в нём происходит нарастание одновременно карбоксильных и аминных групп в эквивалентных количествах. Для определения количества карбоксильных групп существует метод формолового титрования Серенсена.

Аминокислоты в водных растворах образуют внутренние соли, поэтому без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот щёлочью невозможно. В процессе реакции с формальдегидом аминогруппа теряет свои основные свойства

HO-C(O)-CH(R)-NH₂ + H₂C(O) = CH₂=N-CH(R)-COOH + H₂O

Образующиеся метиленовые соединения легко можно оттитровать щелочью.

CH₂=N-CH(R)-COOH + NaOH = CH₂=N-CH(R)-COONa + H₂O

Метод формолового титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучать действие протеолитических ферментов.

Конец гидролиза белка совпадает с моментом, когда количество аминных и карбоксильных групп в гидролизате перестаёт увеличиваться и наступает момент, когда биуретовая реакция – отрицательна.

Реактивы:                                                          Оборудование:

животный уголь, измельчённый                   конические колбы на 50 мл, 2шт.

уксусная к-та, 1% -ный р-р                              пипетки на 1 и 2 мл, 2 шт.

формалин нейтральный, 20%-ный  р-р         микробюретки, 2шт.

фенолфталеин                                                    цилиндр мерный на 25 мл.

едкий натр, 0. 005 N р-р

 соляная к-та, 1%-ный р-р

Ход работы:

1. Титрование карбоксильных групп в растворе белка до гидролиза

Отмеривают в колбу 1 мл раствора белка, добавляют 5 капель 20%-ого раствора формалина и 3 капли фенолфталеина. Титруют до устойчивой розовой окраски 0, 005 N раствором NaOH из микробюретки.

2. Титрование карбоксильных групп в растворе белка после гидролиза                   (в гидролизате)

Через 45 или 90 минут гидролиз прерывают.

Пробку с холодильником удаляют, а в колбу всыпают (на кончике ножа) животного угля для обесцвечивания буроватого раствора, взбалтывают и кипятят 5 минут. Затем гидролизат охлаждают, выливают в цилиндр, доводят объём жидкости до 25 мл дистиллированной водой и фильтруют. Для титрования отмеривают 1, 25 мл гидролизата, количественно соответствующее 1 мл раствора белка, фенолфталеин и нейтрализуют 10%-ным раствором NaOH из бюретки до слабо-розовой окраски (щёлочь используется для нейтрализации HCl, и поэтому количество щёлочи не учитывается).

    Если окраска делается ярко-красной, то добавляют до обесцвечивания по каплям 1%-ный раствор  HCl или 1%-ный раствор CH₃COOH, избыток который нейтрализуют 0, 005 N р-ром NaOH до слабо-розовой окраски. Затем приливают 5 капель нейтрального раствора формалина.

    Вследствие блокирования аминогрупп формальдегидом и освобождения карбоксильных групп раствор приобретает кислую реакцию и фенолфталеин обесцвечивается.

    Для определения свободных карбоксильных групп раствор титруют щелочью из микробюретки 0, 005 N р-ром NaOH до розовой окраски и точно отмеряют количество затраченной щелочи. Рассчитывают, какое количество азота аминогрупп в мг появилось в исследуемом растворе. Атомная масса  азота – 14. Нормальному раствору щелочи соответствует 14 г азота в 1л или 14 мг в 1 мл. Отсюда 1 мл 0, 005 N раствора соответствует 0, 07 мг азота.

    Результаты заносят в таблицу.

Ход работы	Количество мл NaOH до гидролиза белка	Количество мл NaOH после 45 минут гидролиза белка	Количество мл NaOH после 90 минут гидролиза белка	Расчет азота аминогрупп по количеству затраченной щелочи

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: