а) Влияние температуры на активность амилазы слюны

а) Влияние температуры на активность амилазы слюны

В четыре пронумерованные пробирки наливают по 2 мл 1% раствора крахмала. Пробирку 1 помещают в кипящую водяную баню, пробирку 2 - в водяную баню при 40°С, пробирку 3 оставляют при комнатной температуре, и пробирку 4 помещают в лед. Через 10 мин., когда содержимое пробирок примет заданную температуру, во все пробирки добавляют по 0, 5 мл разбавленной в 10 раз слюны, перемешивают с помощью стеклянной палочки и оставляют в тех же условиях. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала ведут по реакции с йодом. Для этого наносят на часовое стекло несколько капель раствора йода в йодиде калия и смешивают их с каплями гидролизуемой смеси из каждой пробирки, беря пробы через 1, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 мин. По изменению окраски крахмала с йодом судят о степени гидролиза крахмала в каждой пробирке. Результаты наблюдений заносят в таблицу, помечая буквой " с" (синяя окраска) положительную пробу с йодом на крахмал, буквой " к" - положительную пробу на декстрины (окраска красных тонов) и буквой " ж" - отрицательную пробу (желтая окраска йода).

 

 

Номер пробирок	Температура  в пробирке  (в °С)	Реакция с йодом по истече­нии времени  минмин)
1
	15-20

 

На основании полученных данных делают вывод о величине температурного оптимума для амилазы слюны.

б) Влияние рН среды на активность ферментов

Ход работы

Серии растворов с определенными ' значениями рН получают, используя фосфатный буфер. Две бюретки заполняют 1/15 М раствором гидрофосфата натрия (Nа₂НР0₄) и 1/15 М раствором дигидрофосфата калия (КН₂Р0₄). Растворы смешивают в определенных соотношениях таким образом, что в каждой пробирке получают по 5 мл буферной смеси с величинами рН: 5, 59; 6, 98; 7, 38; 8, 04. В каждую из четырех пробирок добавляют по 1 мл 0, 5%-ного раствора крахмала, 1 мл разбавленной в 10 раз слюны и тщательно перемешивают содержимое с помощью стеклянной палочки. Далее все пробирки, не вынимая из них стеклянных палочек, помещают в водяную баню, нагретую до 40°С. Спустя 3-5 мин. из всех пробирок палочками наносят на фарфоровую пластину по капле смеси рядом с предварительно уже нанесенными на нее каплями раствора йода. Капли соединяют и, если наблюдается различие в окраске с йодом в испытуемых пробах, про­бирки вынимают из бани, охлаждают и добавляют в каждую по 3-4 капли раствора йода в йодиде калия. При отсутствии заметного различия в окраске проб с йодом на фарфоровой пластинке продолжают нагревание пробирок в водяной бане еще несколько минут. Затем вновь испытывают на пластинке пробы на степень расщепления крахмала. Эту операцию повторяют До тех пор, пока не произойдет заметных сдвигов в окраске проб с йодом. Продолжают инкубацию всех проб в присутствии добавленного йода и для каждой из них отмечают время, когда исчезнет синее окрашивание (окончание амилолитического расщепления). Полученные результаты выражают графически: по оси абсцисс наносят значение рН опытов, а по оси ординат - время расщепления крахмала при соответствующих значениях рН. Соединяя точки линией, получают кривую, характеризующую зависимость активности фермента от значений рН среды.

в) Действие активаторов и ингибиторов на амилазу слюны

Ход работы

В штативах располагают тремя рядами 36 пробирок и нумеруют их в каждом ряду. Во все пробирки вливают из бюретки по 1 мл воды, а затем в первые пробирки каждого ряда - по 1 мл профильтрованной неразбавленной слюны. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Далее в каждом ряду 1 мл смеси из пробирки 1 переносят в пробирку 2, перемешивают, снова набирают 1 мл смеси и переносят в пробирку и т. д. вплоть до пробирки 12, из которой после перемешивания выливают 1 мл жидкости.

Во все пробирки первого ряда наливают по 1 мл воды (контрольный ряд); в пробирки второго ряда - по 1 мл раствора хлорида натрия и в пробирки третьего ряда - по 1 мл раствора сульфата меди. Далее во все пробирки приливают из бюретки по 2 мл раствора крахмала в следую­щем порядке: сначала в первые номера всех рядов, затем во вторые и т. д. Содержимое пробирок перемешивают и ставят штативы с пробир­ками в термостат при 4О⁰С на 15 мин, По охлаждении в каждую из них добавляют по капле раствора йода в йодиде калия и отмечают в каж­дом ряду номер пробирки, в которой реакция на крахмал отрицательна. Деля степень разведения контрольной пробы, в которой реакция с йодом отрицательна, на степень разведения соответствующих проб с исследуемыми эффекторами, вычисляют во сколько раз активатор (NаС1) или ингибитор (СuS0₄) стимулирует или тормозит действие ами­лазы слюны.

г) Гидролиз крахмала под действием амилазы слюны

                                            Ход работы:

В две пробирки наливают по 5 мл крахмального клейстера и в одну из них - 5 мл воды, а в другую - 5 мл раствора слюны. Обе пробирки со стеклянными палочками, погруженными в них, одновременно помеща­ют в водяную баню при 40°С. Через 1 мин. от каждой смеси отбирают с помощью стеклянной палочки по капле жидкости и смешивают их по отдельности с каплей йода, заранее нанесенной на пластинку. Повто­ряют взятие проб через 2, 4, 6 и 8 мин. Окраска с йодом проб из про­бирки, содержащей слюну, меняется от синей к сине-фиолетовой, буро-красной, красной и, наконец, желтой.

К содержимому пробирки со слюной добавляют 1-2 мл фелинговой жидкости и смесь нагревают до начала кипения. Образуется красный осадок оксида меди (I) за счет восстановления гидроксида меди (II), образовавшейся мальтозой и низкомолекулярными декстринами. Кон­трольная проба в тех же условиях не восстанавливает гидроксид меди (II) в оксид меди (I).

Схема гидролиза крахмала в присутствии амилазы слюны:

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: