 |
B) процедура теста . С. Требования к вакцинам
|
|
|
|
b) Процедура теста
i) Следует определить необходимое число тестовых полосок, принимая во внимание, что для каждой нитроцеллюлозной пластины, определяющей один перемещенный гель, необходимо провести анализ положительной, слабоположительной, пороговой и отрицательной контрольной сыворотки. В целом, из геля должно получится 24 нитроцеллюлозных полоски, каждая шириной 3 мм.
ii) В каждую лунку добавляют 0, 8 мл насыщающего буфера (50 мM Tris/HCI, рН 7, 5; 150 мM NaCl; 0, 2% Твин 20, 5% обезжиренное сухое молоко; и 0. 05% бактериальный лизат E. coli). Сенсибилизированные антигеном полоски блокируют посредством размещения лотков на шюттль-аппарат и встряхивают в течение 30 минут при комнатной температуре (20-22°С).
iii) Разведение в 1/200 тестируемых сывороток и каждого из контролей добавляют в подходящий лоток. Полоски должны быть полностью погружены и расположены лицом вверх, и должны находиться в таком положении в течение всего процесса.
iv) Полоски инкубируют в течение 60 минут на шюттль-аппарате при комнатной температуре.
v) Жидкость удаляют из лотков, и каждую тестовую полоску промывают три раза промывочным раствором (50 мM Tris/HCI, рН 7, 5; 150 мM NaCl; 0, 2% Твин 20), путем взбалтывания в течение 5 минут.
vi) В каждую лунку добавляют конъюгированный с щелочной фосфатазой кроличий анти-бычий раствор, после чего полоски инкубируют посредством встряхивания в течение 60 минут при комнатной температуре.
vii) Жидкость удаляют из лотков, и каждую тестовую полоску промытва три раза промывочным раствором, описанном выше.
viii) Раствор субстрата (0, 015% бромохлориндолилфосфат/0. 03% нитросиний тетразолий) готовят в субстратном буфера (100 мM NaCl; 5 мM MgCl2; 100 мM Tris/HCI, рН 9, 3) и добавляют в каждую тестовую лунку.
|
|
|
ix) Полоски инкубируют, поместив тестовый лоток на орбитальный миксер и встряхивая до тех пор, пока контроль точки разделения не покажет 5 отчетливо видимых полос. Полоски промывают проточной деионизированной водой и высушивают на воздухе.
x) Интерпретация результатов: Результаты иммуноферментного электроблоттинга (EITB) можно сканировать с помощью денситометра, хотя визуальный метод, несмотря на его бó льшую субъективность, также считается подходящим. Производят тестирование отдельных контрольных сывороток, которые демонстрируют минимальное, но стойкое окрашивание для каждого из пяти антигенов. Тестируемый образец считается положительным, если антигены 3ABC, 3A, 3B и 3D (±2C) демонстрируют плотность окрашивания равную или выше, чем таковая у их соответствующих контролей. Образец считается отрицательным, если два или более антигенов демонстрируют плотность ниже, чем у их контрольных
сывороток. Тестируемые образцы, не соответствующие ни одному из профилей, считаются сомнительными.
С. ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИНАМ
Контроль ящура лежит в сфере национальной и региональной ответственности, вследствие чего во многих странах вакцины могут быть использованы только под контролем ветеринарных органов.
Указания по производству ветеринарных вакцин приведены в главе 1. 1. 8 Принципы производства ветеринарных вакцин. Указания, представленные здесь и в Главе 1. 1. 8, намеренно являются общими по своей природе и могут быть дополнены национальными и региональными требованиями. В отдельных странах и регионах применяются различные требования, касающиеся качества, безопасности и эффективности, для получения производителем разрешения или лицензии на производство ветеринарной вакцины. По возможности, производители должны стремиться получать такое разрешение или лицензию на свои противоящурные вакцины, в качестве независимого подтверждения качества производимого ими продукта.
|
|
|
Объекты по производству противоящурной вакцины должны осуществлять свою деятельность при наличии соответствующих процедур биобезопасности и защиты, как указано в Главе 1. 1. 4 Биобезопасность и биозащита: Стандарты по управлению биологическим риском в ветеринарной лаборатории и виварии.
Рутинная вакцинация против вируса ящура проводится во многих странах или зонах, признанных свободными от ящура с вакцинацией, и в странах, где данная болезнь является эндемичной. Напротив, в ряде стран, свободных от болезни, никогда не проводилась вакцинация своих сельскохозяйственных животных, а предпочтение отдавалось использованию строгого контроля перемещения животных и выбраковке инфицированных и контактирующих с ними животных в случае вспышек. Несмотря на это, многие страны, свободные от болезни, не отказываются от опции проведения вакцинации и имеют свои собственные стратегические запасы высококонцентрированных инактивированных вирусных препаратов. Такие запасы антигена обеспечивают возможность поставки полученных вакцин в чрезвычайной ситуации и в короткие сроки (См. также Главу 1. 1. 10 Банки вакцин).
Традиционные вакцины против вируса ящура могут быть охарактеризованы, как имеющие фиксированный состав, включающий определенное количество (предельно допустимое количество) одного или более химически инактивированных полученных посредством клеточного культивирования препаратов посевного вируса, смешанных с подходящим адъювантом/ми и вспомогательными веществами. См. Главу 1. 1. 8 относительно вакцин, произведенных на основе биотехнологий, таких как рекомбинантные или пептидные вакцины.
Банки антигенов можно охарактеризовать, как запасы антигенных компонентов, зарегистрированных или лицензированных соответственно конечной вакцине, и которые можно хранить при ультранизких температурах в течение продолжительного периода времени для последующего составления вакцин, как и когда потребуется.
Составление вакцин производят для конкретной цели, и в случае, когда вакцины предназначены для использования у КРС, можно использовать вакцины на основе таких адъювантов, как гидроокись алюминия, сапонин и масляный адъювант. Для использования у свиней предпочтительны двойные масляные эмульсии по причине их эффективности.
|
|
|
Противоящурные вакцины можно классифицировать на вакцины со «стандартной» и «более высокой» иммуногенностью. Составление вакцин со стандартной иммуногенностью производят таким образом, чтобы они содержали достаточное количество антигена и соответствующий адъювант, для гарантирования их соответствия минимально требуемому уровню иммуногенности (рекомендованные 3PD50 [50% протективная доза]; 75% ЕРР (ожидаемый процент защиты) или 12 защищенных животных из 16 вакцинированных и подвергнутых контрольному заражению в PGP тесте [тест для определения степени защиты от генерализованной инфекции нижних конечностей]) в течение срока годности, заявленного производителем. Этот тип вакцины обычно подходит для кампании рутинной вакцинации. Для вакцинации интактных популяций с целью контроля вспышек ящура, рекомендуются использовать вакцины с более высокой степенью иммуногенностью (например, > 6 PD50 в течение срока годности, заявленного производителем) ввиду их более широкого спектра предоставляемого иммунитета, а также быстрого наступления защиты.
По причине наличия множества серотипов вируса, общепринятой практикой является изготовление вакцин из двух или более различных серотипов вируса. В отдельных районах, возможно целесообразно, включать больше одного штамма вируса на серотип для обеспечения широкого антигенного охвата против превалирующих вирусов.
|
|
|
